Введение
Corynebacterium urealyticum (C. urealyticum) является клинически значимым, но нередко недооцененным возбудителем инфекций мочевыводящих путей у собак и кошек. В ветеринарной практике инфекция, вызванная этим микроорганизмом, проявляется дизурией, гематурией, пиурией, щелочной реакцией мочи, струвитной кристаллурией и формированием инкрустирующего цистита1,2.Клиническая значимость C. urealyticum обусловлена его уреазной активностью, устойчивостью к антимикробным препаратам и способностью индуцировать персистирующее воспаление в мочевом тракте. Описанные случаи у собак и кошек демонстрируют, что инфекционный процесс нередко развивается на фоне предшествующих урологических нарушений, катетеризации или урологических вмешательств и может сопровождаться формированием инкрустирующих поражений и уролитов1,3-4.
Лабораторная диагностика инфекции, вызванной C. urealyticum, представляет собой сложную задачу вследствие медленного роста возбудителя, строгих требований к условиям культивирования и фенотипического сходства с другими коринеформными бактериями1,2.
Дополнительные трудности создают преаналитические факторы, включая сроки и условия доставки биоматериала, которые могут влиять на жизнеспособность микроорганизма и, следовательно, на результат культурального исследования.
В этой связи молекулярные методы, прежде всего ПЦР, могут рассматриваться как дополнительный инструмент диагностики, позволяющий повысить вероятность выявления возбудителя и сократить время до получения результата. Преимуществом молекулярного подхода является независимость от сохранения жизнеспособности бактерий, что особенно важно при неблагоприятных условиях транспортировки и хранения образцов; вместе с тем при контроле эффективности лечения бактериологический метод сохраняет особое значение, поскольку позволяет получать живую культуру для определения антимикробной чувствительности и оценки эрадикации возбудителя1,2.
Настоящая работа направлена на сопоставление молекулярного и бактериологического подходов к выявлению C. urealyticum у мелких домашних животных с оценкой аналитической специфичности, чувствительности и влияния преаналитических факторов.
Материалы и методы
Материал исследования составили клинические изоляты коринебактерий, полученные из мочи и биоптатов собак и кошек с признаками урологической патологии. Видовая идентификация изолятов проводилась с использованием метода MALDI-TOF-масс-спектрометрии на приборе Autof MS 1000 (Autobio Diagnostics, Китай) и референсной базы данных. Подбор изолятов осуществляли таким образом, чтобы включить целевой вид C. urealyticum, а также другие виды коринебактерий, часто встречающиеся в клиническом материале и потенциально способные вызывать ложноположительные результаты при недостаточно специфичной молекулярной детекции:C. renale, C. amycolatum, C. auriscanis, C. ulcerans, C. kroppenstedtii и C. aurimucosum. Такой дизайн позволял оценить аналитическую специфичность тест-систем и исключить перекрестные реакции с близкородственными видами. Все культуры стандартизовали до плотности 0,5 по стандарту МакФарланда в физиологическом растворе. Бактериологический посев с последующей идентификацией выделенных колоний использовали в качестве референсного метода. На его основе оценивали диагностическую эффективность молекулярного подхода.
Эксперимент включал три этапа:
- Оценку специфичности и чувствительности на чистых культурах.
- Моделирование присутствия возбудителя в моче.
- Исследование влияния преаналитических факторов.
Для детекции C. urealyticum использовали две тест-системы. Положительным результатом считали наличие сигнала амплификации до порогового цикла (Ct) 40 включительно в одной системе и до 38 включительно – в другой. ПЦР-амплификацию проводили на приборе Fluorite (Analytik Jena, Германия). Каждый образец исследовали в двух технических повторах.
В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Положительный контроль для обеих систем представлял собой ПКО (положительный контрольный образец) C. urealyticum, входящий в состав наборов.
Для каждого образца рассчитывали среднее значение Ct по двум техническим повторам, а для условий с биологическими дублями – дополнительно среднее значение по двум независимым выделениям. Оценивали чувствительность и специфичность молекулярного метода относительно бактериологического посева как референсного метода. Для оценки воспроизводимости вычисляли абсолютную разность ΔCt между повторами и коэффициент вариации.
Влияние температуры и времени хранения оценивали путем парного сравнения средних значений Ct для каждой пары температурных режимов, отдельно для 24 и 72 ч. Статистическую обработку выполняли с использованием стандартных методов статистического анализа.
Результаты
При исследовании панели изолятов, не относящихся к C. urealyticum, положительных сигналов в обеих тест-системах не было получено. Перекрестной реакции с C. renale, C. amycolatum,C. auriscanis, C. ulcerans, C. kroppenstedtii и C. aurimucosum не было выявлено, что свидетельствует о высокой аналитической специфичности обеих ПЦР-тест-систем в условиях настоящего исследования.
При исследовании чистых культур C. urealyticum первая тест-система с пороговым значением Ct 40 продемонстрировала более высокую выявляемость по сравнению со второй системой с порогом Ct 38. Первая система выявляла практически все образцы, тогда как во второй положительный результат был получен примерно у половины. Образцы, не детектированные во второй системе, преимущественно характеризовались более высокими значениями Ct, что соответствовало меньшей концентрации ДНК.
При анализе нативного и культурального материалов первая система выявляла C. urealyticum во всех культуральных образцах и в подавляющем большинстве нативных, тогда как вторая система продемонстрировала меньшую чувствительность, особенно при низкой бактериальной нагрузке, что указывает на ограниченную применимость метода в таких условиях.
Исследование влияния условий хранения мочи на результаты молекулярного анализа показало, что хранение при температуре +4 °C и –20 °C не сопровождалось значимым увеличением Ct по сравнению с образцами, исследованными сразу после взятия; различия, как правило, были минимальными. Напротив, хранение при комнатной температуре приводило к повышению Ct и увеличению вариабельности результатов, особенно при увеличении срока хранения до 72 ч, что указывает на неблагоприятное влияние комнатной температуры на сохранность диагностической информативности образцов мочи перед молекулярным исследованием.
Техническая воспроизводимость метода была высокой: разность Ct между повторами в подавляющем большинстве случаев не превышала 0,5. Биологическая воспроизводимость также оставалась удовлетворительной: при двух независимых выделениях значения Ct для одного и того же образца различались не более чем на 1 цикл.
Обсуждение
Сопоставление результатов двух ПЦР-тест-систем с данными бактериологического посева позволяет оценить диагностическую ценность молекулярного подхода при выявленииC. urealyticum.
В научных публикациях инфекция, вызванная данным микроорганизмом, ассоциирована с хроническим и рецидивирующим течением, сдвигом pH мочи в щелочную сторону, струвитной кристаллурией, инкрустирующим циститом и наличием предрасполагающих урологических нарушений1,5. Медленный рост и липофильность C. urealyticum значительно затрудняют культуральную диагностику, что обосновывает интерес к молекулярным методам как к дополнительному инструменту выявления возбудителя. В то же время высокая частота множественной лекарственной устойчивости, характерная для данного микроорганизма, подчеркивает необходимость сохранения бактериологического посева как метода, позволяющего получить чистую культуру для определения чувствительности к антибиотикам и контроля эффективности терапии6.
Сопоставление молекулярного и бактериологического подходов показывает, что методы решают разные диагностические задачи. ПЦР обеспечивает более быстрое выявление возбудителя и не требует сохранения жизнеспособности бактерий, тогда как бактериологический посев позволяет получить чистую культуру для определения антимикробной чувствительности и оценки микробиологического ответа на терапию, поскольку отражает наличие жизнеспособного возбудителя1,6. Именно поэтому наиболее рациональным представляется комбинированное использование обоих методов, а не их взаимная замена.
Полученные данные указывают на необходимость предварительной аналитической валидации новых молекулярных тест-систем. Различия между тест-системами по чувствительности при сопоставимой специфичности свидетельствуют о том, что диагностическая ценность ПЦР определяется не только самим принципом метода, но и характеристиками конкретного набора, включая порог детекции и состав амплификационной системы.
Отдельного внимания требует интерпретация положительной ПЦР после антибактериальной терапии. Возможность детекции бактериальной ДНК при отсутствии жизнеспособных клеток ограничивает использование молекулярного метода для контроля эрадикации. В этом контексте бактериологический посев сохраняет преимущество при динамическом наблюдении, поскольку позволяет оценивать наличие жизнеспособного возбудителя и микробиологический ответ на терапию6.
Преаналитические условия также оказывают влияние на диагностическую результативность. Хранение мочи при +4 °C и –20 °C в течение 24–72 ч не приводило к существенному влиянию на выявление C. urealyticum, тогда как при комнатной температуре отмечалось ухудшение показателей и рост вариабельности значений Ct. Эти данные подтверждают необходимость охлаждения или замораживания материала при невозможности немедленного исследования, особенно в случаях предполагаемой низкой бактериальной нагрузки.
Результаты настоящего исследования позволяют рассматривать ПЦР как эффективный метод раннего выявления C. urealyticum, при этом бактериологический посев сохраняет ключевое значение для выделения чистой культуры, определения антимикробной чувствительности и микробиологической верификации. Комбинированный подход, включающий ПЦР и бактериологический посев, представляется наиболее обоснованным при подозрении на инкрустирующий цистит, рецидивирующую инфекцию мочевых путей, а также в случаях, когда сроки доставки или условия хранения материала могут ограничивать информативность культурального исследования1,6.
Список литературы:
- Maurey C., Boulouis H. J., Canonne-Guibert M., Benchekroun G. Clinical description of Corynebacterium urealyticum urinary tract infections in 11 dogs and 10 cats. J Small Anim Pract, 60(4):239–246, 2019. doi:10.1111/jsap.12973
- Suarez M. L., Espino L., Vila M., Santamarina G. Urinary tract infection caused by Corynebacterium urealyticum in a dog. J Small Anim Pract, 43(7):299–302, 2002. doi:10.1111/j.1748-5827.2002.tb00077.x
- Briscoe K. A., Barrs V. R., Lindsay S., Hoffmann K. L., Cockwill K. R., Muscatello G., Beatty J. A. Encrusting cystitis in a cat secondary to Corynebacterium urealyticum infection. J Feline Med Surg, 12(12):972–977, 2010. doi:10.1016/j.jfms.2010.07.007
- Coady M., Lunn K. F., Street L. Corynebacterium urealyticum urinary tract infection in a cat. Aust Vet J, 92(7):250–254, 2014. doi:10.1111/avj.12168
- Cavana P., et al. Corynebacterium urealyticum urinary tract infection in dogs and cats: 7 cases (1996–2003). J Am Vet Med Assoc, 226(10):1676–1680, 2005. doi:10.2460/javma.2005.226.1676
- Salem N., Salem L., Saber S., Ismail G., Bluth M. H. Corynebacterium urealyticum: a comprehensive review of an understated organism. Infect Drug Resist, 8:129–145, 2015. doi:10.2147/IDR.S74795
vetpeterburg
Ветеринарный Петербург